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    transnetyx表達(dá)歷史進(jìn)行遺傳追蹤將樹(shù)突狀細(xì)胞定義為造血譜系

    發(fā)布時(shí)間: 2022-08-25  點(diǎn)擊次數(shù): 1634次

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    通過(guò) DNGR-1 表達(dá)歷史進(jìn)行遺傳追蹤將樹(shù)突狀細(xì)胞定義為造血譜系

    作者鏈接打開(kāi)覆蓋面板芭芭拉·U·施拉姆1詹內(nèi)克··布里斯韋克1圣地亞哥澤萊奈1保羅·惠特尼1安德魯·菲爾比2蘇菲·E·阿克頓13尼爾·C ·羅杰斯1娜塔莉亞·蒙考特4海梅·J·卡瓦哈爾45卡埃塔諾·雷斯·索薩1

    Elsevier用戶許可下打開(kāi)存檔

    被引用

    Carmen GerlachAude ThiriotUlrich H. von Andrian

    起源和譜系:樹(shù)突狀細(xì)胞的譜系追蹤

    單元格,第 154 卷,第 4 期,2013 8 15 日,第 720-722 頁(yè)

    下載PDF

    強(qiáng)調(diào)

    •DNGR-1 標(biāo)記 DC 前體

    追蹤 DNGR-1 表達(dá)歷史定義了常規(guī) DC

    分析揭示了非淋巴組織中以前未被重視的 DC 群體

    •DC的個(gè)體發(fā)育定義有助于闡明單核吞噬細(xì)胞功能

     

    概括

    基于細(xì)胞形態(tài)、表型或選擇的功能特性,單核吞噬細(xì)胞被分類為巨噬細(xì)胞或樹(shù)突狀細(xì)胞 (DC)。然而,這些屬性不是絕對(duì)的并且經(jīng)常重疊,導(dǎo)致細(xì)胞類型識(shí)別困難。為了規(guī)避這個(gè)問(wèn)題,我們描述了一個(gè)小鼠模型,以根據(jù)它們從承諾前體的個(gè)體遺傳后代來(lái)定義 DC。我們表明,小鼠常規(guī) DC 的前體,而不是其他白細(xì)胞,以 DNGR-1 的表達(dá)為標(biāo)志。DNGR-1 表達(dá)歷史的遺傳追蹤特別標(biāo)記了傳統(tǒng)上歸屬于DC 譜系的細(xì)胞,并且這種限制在炎癥后保持不變。值得注意的是,在某些組織中,以前被認(rèn)為是單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的細(xì)胞實(shí)際上是 DC 前體的后代。這些研究為 DCs 的命運(yùn)圖譜提供了體內(nèi)模型,將它們與其他白細(xì)胞譜系區(qū)分開(kāi)來(lái),從而有助于揭示單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的功能復(fù)雜性。

     

    圖形概要

     

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    介紹

    樹(shù)突狀細(xì)胞 (DC) 在免疫調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。從以前看,DC 已被鑒定為具有樹(shù)突形態(tài)的非淋巴細(xì)胞運(yùn)動(dòng)細(xì)胞,表達(dá)高水平的主要組織相容性復(fù)合物II 類分子 (MHCII) 和整合素CD11c ( Geissmann 等人,2010,Hashimoto 等人,2011,Heath Carbone, 2009 年,斯坦曼和伊多亞加,2010 年)。此外,功能標(biāo)準(zhǔn),包括遷移能力和刺激T 淋巴細(xì)胞的能力,通常用于區(qū)分 DC 與其他單核吞噬細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞 (M?s) 和單核細(xì)胞( Hashimoto et al., 2011,Milling et al., 2010,Steinman and Idoyaga, 2010)。然而,功能屬性不是離散的細(xì)胞特性,表型標(biāo)記通常在相關(guān)細(xì)胞類型之間共享,特別是在感染后或炎癥期間,當(dāng)它們上調(diào)和下調(diào)時(shí)。無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分 DCs M?s 導(dǎo)致了混亂和爭(zhēng)論,并且難以評(píng)估單個(gè)單核吞噬細(xì)胞亞型是否在免疫系統(tǒng)中具有的功能(Hashimoto 等人,2011 年,Hume,2008 年)。

     

    基因表達(dá)分析和個(gè)體發(fā)生關(guān)系已被用于細(xì)化 DCs M?s 的定義。例如,通過(guò)比較基因表達(dá)特征和/或證明給定種群的發(fā)展取決于特定的轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子、或生長(zhǎng)因子(Gautier 等人,2012 年, Geissmann 等人,2010 年, Greter 等人,2012 年, Haniffa 等人,2012 年, Hashimoto 等人,2011 年, Heath Carbone,2009 年, Hildner 等人, 2008 年,梅雷迪思等人,2012a年,Miller et al., 2012 , Persson et al., 2013 , Satpathy et al., 2012 , Satpathy et al., 2011 , Schlitzer et al., 2013 , Schulz et al., 2012 , Tussiwand et al., 2012 )。盡管如此,仍然需要統(tǒng)一 DC 家族并將其確立為獨(dú)立的白細(xì)胞譜系的總體個(gè)體遺傳學(xué)定義(Hashimoto 等人,2011 年)。

     

    缺乏譜系限制標(biāo)記 (lin) 并表達(dá) CD115M-CSF 受體)、 CD135  CX 3 CR1 和低水平CD117c-kit )的小鼠骨髓 (BM) 細(xì)胞, 干細(xì)胞因子受體) 在體外培養(yǎng)或轉(zhuǎn)移到小鼠體內(nèi)后僅產(chǎn)生 DC, 被稱為常見(jiàn) DC 前體 (CDP) ( Auffray et al., 2009 , Liu et al., 2009 , Naik et al., 2007 , Onai 等人,2007 年)。CDP 不會(huì)離開(kāi) BM,但會(huì)產(chǎn)生前 DC,它們通過(guò)血液遷移到淋巴和非淋巴器官,在那里它們最終分化為常規(guī) DC (cDC),包括兩個(gè)主要的 CD11b + CD11b– cDC 子集(Ginhoux 等人,2009 年,Liu 等人,2009 年,Naik 等人,2006 年,Naik 等人,2007 年,Onai 等人,2007 年)。相比之下,漿細(xì)胞樣 DCs (pDCs) 被認(rèn)為是獨(dú)立于前 DCs 衍生自 CDPs ( Liu et al., 2009 , Naik et al., 2007 , Onai et al., 2007 ),盡管它們的 CDP 起源最近受到質(zhì)疑(Onai 等人,2013 年)。

     

    由于個(gè)體發(fā)育是不可變的,CDP 和前 DC 后代的跟蹤應(yīng)允許定義DC 譜系,而不管標(biāo)記或功能標(biāo)準(zhǔn)如何。這將有助于解決單核吞噬細(xì)胞家族內(nèi)的命名問(wèn)題,并為研究穩(wěn)態(tài)和炎癥或感染后的 DC 動(dòng)力學(xué)提供系統(tǒng)。在這里,我們報(bào)告可以通過(guò) C 型凝集素受體 DNGR-1 的表達(dá)在小鼠中定義 cDC 的前體,并描述了表達(dá) DNGR-1 的細(xì)胞及其后代的遺傳標(biāo)記模型,該模型允許對(duì) DC 進(jìn)行個(gè)體遺傳學(xué)定義小鼠的血統(tǒng)。

     

    結(jié)果

    DNGR-1 標(biāo)記 CDP Pre-DC

    DNGR-1(也稱為 CLEC9A)在小鼠中由 CD8α + CD103 + CD11b - cDCs 高水平表達(dá),而 pDCs 在較低水平表達(dá)(Caminschi 等人,2008 年,Poulin 等人,2012 年,Sancho 等人。 , 2008 年)。我們還注意到脾前 DCs 上存在低水平的受體,定義為lin - CD11c + CD43 + CD135 + CD172a低細(xì)胞 ( Naik et al., 2006 ),來(lái)自野生型,但不是對(duì)照 DNGR-1 -缺陷( Clec9a gfp/gfp ) 小鼠 ( Sancho et al., 2009 ; S1 A 可在線獲?。?。來(lái)自 BM 的前 DCs 也表達(dá) DNGR-1(圖 S1 B)。在該器官中,在 lin - CD11c - CD115 +隔室中還發(fā)現(xiàn)了DNGR-1 +細(xì)胞,其中包括 M?/DC 前體(MDP;Fogg 等人,2006)和 CDP(圖1A)。然而,DNGR-1 表達(dá)與較低水平的CD117相關(guān)(圖1A),這是一種在轉(zhuǎn)移研究中與 CDP 活性相關(guān)的表型(Auffray 等人,2009 年,Naik 等人,2007 年,Onai 等人,2007 年)。事實(shí)上,我們發(fā)現(xiàn) CD117 上的單峰 DNGR-1 表達(dá)低,但不在 CD117 hi細(xì)胞或來(lái)自對(duì)照Clec9a gfp/gfp BM CD117 low細(xì)胞上( Sancho 等人,2009)(圖1A S1C)。lin - CD11c - DNGR-1 +細(xì)胞另外表達(dá) CD135,但不表達(dá) CD127 (IL-7Rα),這是淋巴前體的標(biāo)志物 ( Schlenner 等人,2010 )(數(shù)據(jù)未顯示),因此表型類似于 CDP。

     

     

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    S1。DNGR-1 專門標(biāo)記 DC 前體和 DNGR-1 +前體細(xì)胞的排序策略和排序后分析,與圖 1相關(guān)

     

    (A) 對(duì) WT Clec9a gfp/gfp小鼠的脾單細(xì)胞懸液進(jìn)行譜系 (lin) 標(biāo)記(Ter119、NK1.1、CD4、CD8、B220、CD11bMHCII)、CD11c、CD43、CD172a DNGR-1 染色并通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。脾前 DC 被鑒定為 lin - CD43 + CD135 + CD172a低細(xì)胞。直方圖疊加顯示來(lái)自 WT(紅線)和Clec9a gfp/gfp小鼠(黑線)的脾前 DCs 上的 DNGR-1 染色。

     

    (B C) 對(duì)來(lái)自 WT Clec9a gfp/gfp小鼠的BM 單細(xì)胞懸液進(jìn)行譜系標(biāo)記、CD11c、CD117CD115 DNGR-1 染色,并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。(B) BM 中的前 DC 被鑒定為 lin - CD11c + CD135 +細(xì)胞并分析 DNGR-1 表達(dá)。與 BM DCs 相比,脾臟上明顯較低的受體表達(dá)可能是由于在用于分離脾細(xì)胞的消化過(guò)程中 DNGR-1 的切割造成的偽影(JvBBUS CRS,未發(fā)表的數(shù)據(jù))。(C) 1 A中確定的 MDP CDP DNGR-1 +細(xì)胞的百分比 ( Auffray et al., 2009 , Fogg et al., 2006, Onai et al., 2007 ) 顯示。每個(gè)符號(hào)代表一只鼠標(biāo),水平條代表平均百分比。

     

    (D) 分選策略:使用磁珠富集BM lin -細(xì)胞(Ter119、NK1.1、CD4、CD8、B220MHCII、CD11b CD11c),并對(duì) CD115、CD117 DNGR-1 進(jìn)行染色。Lin - CD115 + DNGR-1 +細(xì)胞被分選。DNGR-1 +門通過(guò)用同種型匹配的對(duì)照抗體染色來(lái)定義(右中圖)。數(shù)字表示每個(gè)門中細(xì)胞的百分比;箭頭表示門控策略。

     

     

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    1。DNGR-1 標(biāo)記具有 cDC 受限分化潛能的細(xì)胞

     

    (A) Lin - (Ter119、NK1.1CD4、CD8B220、CD11b MHCII)CD11c -來(lái)自 WT BM 細(xì)胞和Clec9a gfp/gfp小鼠通過(guò)流動(dòng)分析 CD117、CD115 DNGR-1細(xì)胞術(shù)。上圖: lin - CD11c - CD115 +細(xì)胞上的 DNGR-1 CD117 表達(dá)。底部: lin - CD11c - CD115 + MDPCD117 hi CD135 +)和 CDPCD117CD135 +)上的 DNGR-1 表達(dá)。

     

    B C)將來(lái)自 CD45.1 B6.SJL 小鼠的 Lin - CD115 + DNGR-1 +細(xì)胞(lin - DNGR-1 +)或總 BM 轉(zhuǎn)移到未照射的 CD45.2 受體中。在第 7 天,分析了 CD45.1 +供體來(lái)源的脾細(xì)胞的譜系標(biāo)記 (B) 的表達(dá)。(C) 分析 CD45.1 + CD11c + MHCII + cDC CD205 CD11b 以識(shí)別 CD205 + CD11b - DC CD11b + CD205 - DCCD11cMHCII - CD45.1 +分析細(xì)胞的譜系標(biāo)記。數(shù)據(jù)代表三個(gè)實(shí)驗(yàn),每組有兩到三只小鼠。

     

    (D E) CD45.1 + lin - CD115 + DNGR-1 + (lin - DNGR-1 + , n = 5) 或總 BM (n = 6) 細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到亞致死照射的 CD45.2 受體中。在第 7 天,分析脾 CD45.1 +細(xì)胞的 CD11c MHCII (D) CD11c SiglecH (E) 表達(dá)。

     

    參見(jiàn)圖 S1。

     

    為了確定 DNGR-1 標(biāo)記具有 DC 限制潛力的祖細(xì)胞,我們從 CD45.1 B6.SJL 小鼠的 BM中分選了 lin - CD115 + DNGR-1 +細(xì)胞,無(wú)論 CD117 水平如何(圖 S1 D;稱為 lin - DNGR-1 +細(xì)胞)并將它們轉(zhuǎn)移到未照射的 CD45.2同類宿主中。對(duì)照(未分級(jí))BM 產(chǎn)生多種淋巴和骨髓譜系,包括 B (B220 + MHCII + )、T (CD3 + ) NK (NK1.1 + CD3 - ) 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞/單核細(xì)胞 (Gr-1 + CD11b + ) cDCs (CD11c +MHCII + ) ( 1B 1C)。相比之下,lin - DNGR-1 +細(xì)胞幾乎只產(chǎn)生 CD11c + MHCII + cDC,包括 CD11b -(也稱為 CD8α +,在此通過(guò) CD205 表達(dá)確定)和 CD11b +亞群以預(yù)期的比率(圖 1 B 1C ; 數(shù)據(jù)未顯示)。

     

    lin - DNGR-1 +細(xì)胞的后包括 CD11cMHCII -細(xì)胞。這些細(xì)胞缺乏 pDC 標(biāo)記 Gr-1、B220 SiglecH,與 CD11cMHCII -源自總 BM 的細(xì)胞相反(圖 1 C),但表達(dá)低水平的 F4/80 CD11b(圖 1 C),表明它們可能構(gòu)成前 DCNaik 等人,2006 年)。與該概念一致,lin - DNGR-1 + BM 細(xì)胞僅產(chǎn)生 CD11c + MHCII + 轉(zhuǎn)移到亞致死照射宿主后的 cDC,其中增加的生態(tài)位有利于供體細(xì)胞的終末分化(圖1D)。相比之下,對(duì)照總 BM 產(chǎn)生了多種細(xì)胞類型,包括 pDC(圖1D 1E)。因此,在過(guò)繼轉(zhuǎn)移中,lin - DNGR-1 +細(xì)胞特異性地產(chǎn)生 cDC,但不產(chǎn)生 pDC 或其他淋巴或骨髓細(xì)胞,這表明 DNGR-1 標(biāo)志著 cDC 限制性前體。我們繼續(xù)將 DNGR-1 + CD11c -前體稱為“CDP",盡管我們的數(shù)據(jù)表明該首字母縮寫詞更好地?cái)U(kuò)展為常規(guī) DC 前體"(見(jiàn)討論)。

     

    Clec9a -Cre 小鼠允許在 BM 中進(jìn)行 CDP 的遺傳標(biāo)記及其在淋巴組織中的后代

    我們假設(shè)追蹤 DNGR-1 的表達(dá)歷史將使我們能夠確定 CDP 和前 DCs 對(duì)單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的個(gè)體發(fā)育貢獻(xiàn)。我們通過(guò)同源重組產(chǎn)生了在Clec9a基因座控制下表達(dá)Cre 重組酶的小鼠(圖 S2 A S2B),并將它們與 Rosa26-stop flox增強(qiáng)型黃色熒光蛋白(YFP)報(bào)告小鼠雜交(Srinivas 等人,2001)(以下簡(jiǎn)稱稱為Clec9a +/+ Rosa +/EYFPClec9a +/cre Rosa +/EYFP小鼠,表明兩個(gè)基因座的基因型)。在Clec9a +/cre Rosa +/EYFP小鼠中,預(yù)計(jì) Cre 介導(dǎo)的floxed終止密碼子切除會(huì)導(dǎo)致 YFP 的組成型表達(dá),從而不可逆地標(biāo)記表達(dá) DNGR-1 的細(xì)胞及其后代。

     

     

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    S2。生成Clec9a -Cre 小鼠和門控策略以識(shí)別免疫細(xì)胞,與圖 2相關(guān)

     

    (A) 顯示了內(nèi)源基因組Clec9a基因座、靶向構(gòu)建體和突變等位基因。用BamHI對(duì)基因組基因座進(jìn)行限制性酶切會(huì)產(chǎn)生 13kb 野生型片段,該片段可被 5' Southern Blot探針檢測(cè)到。在目標(biāo)等位基因中,5' 探針檢測(cè)到一個(gè) 9.3kb 片段。使用跨越 3' 同源臂并產(chǎn)生 2.2kb PCR 產(chǎn)物的 PCR 篩選ES 細(xì)胞克隆的靶向性。

     

    (B) ES 細(xì)胞中靶向Clec9a等位基因的 Southern Blot 分析。5' 探針用于雜交來(lái)自對(duì)照和靶向 ES 細(xì)胞的 BamHI 消化的基因組 DNA 。

     

    (C) 用于識(shí)別淋巴 (C) 和骨髓 (D) 細(xì)胞譜系的門控策略。(C) 對(duì)來(lái)自Clec9a +/cre Rosa +/EYFP的脾消化物的單細(xì)胞懸浮液進(jìn)行染色,以獲得所示的細(xì)胞表面標(biāo)志物。繪圖在活細(xì)胞(Dapi 陰性)上預(yù)先設(shè)門,具有白細(xì)胞散射分布和低自發(fā)熒光(以排除紅髓 M?)。顯示了 T 細(xì)胞 (CD3 + NK1.1 - )、NKT 細(xì)胞(CD3 + NK1.1 + )NK 細(xì)胞 (NK1.1 + CD3 - ) B 細(xì)胞 (CD19 + CD3 - )上的 YFP 表達(dá)。

     

    (D) 分析了具有白細(xì)胞散布的活細(xì)胞的表面標(biāo)志物的表達(dá)。紅髓 M?s 被鑒定為 F4/80 hi自發(fā)熒光細(xì)胞。在剩余的細(xì)胞部分中, Ly-6G + CD11b +陽(yáng)性細(xì)胞被鑒定為嗜中性粒細(xì)胞。在剩余部分中,CD11b + Gr-1 hi細(xì)胞被鑒定為 Ly-6C hi單核細(xì)胞,具有高 SSC 和低 FSC 譜的Gr-1低細(xì)胞被鑒定為嗜酸性粒細(xì)胞。(C, D) 用于識(shí)別 YFP 陽(yáng)性細(xì)胞的門設(shè)置在Clec9a +/+ Rosa +/EYFP對(duì)照小鼠(未顯示)。

     

    我們首先驗(yàn)證了Clec9a驅(qū)動(dòng)的 Cre DC 前體中是活躍的。實(shí)際上,在 CDP 和前 DC 中檢測(cè)到 YFP,但在Clec9a +/cre Rosa +/EYFP小鼠的 MDP 中未檢測(cè)到,如表型所定義(圖2A -2C)。然而,只有一小部分 DC 前體被標(biāo)記,表明在群體水平上終止密碼子的重組是不完整的(見(jiàn)下文)。盡管如此,我們?cè)?span>Clec9a +/cre Rosa +/EYFP的脾臟中發(fā)現(xiàn)了 YFP +細(xì)胞 ,但沒(méi)有發(fā)現(xiàn) Clec9a +/+ Rosa +/EYFP小鼠(圖 2 D-2F)。大多數(shù) YFP +脾細(xì)胞 是 CD11c + MHCII + cDCs (86.9% ± 4%),而一小部分 (1.7% ± 0.4%) 類似于 F4/80 hi自發(fā)熒光紅髓 M?s。其余的是 CD11cMHCII/-并且包括表達(dá) SiglecH、B220 Gr-1 的細(xì)胞,但不包括類似于 pDC CD11b(圖2D 2E)。YFP 信號(hào)是細(xì)胞自主的,不是由旁觀者攝取 YFP +細(xì)胞或細(xì)胞碎片引起的,這是通過(guò)使用混合 BM 嵌合體確定的(圖 2 G)。圖像分析進(jìn)一步支持了這一點(diǎn),顯示 YFP 的均勻細(xì)胞溶質(zhì)而不是內(nèi)體定位(圖2H)。YFP +的系統(tǒng)分析脾細(xì)胞顯示 BT、NK NKT 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞或 Ly-6C hi單核細(xì)胞的貢獻(xiàn)最?。▓D 2 F、S2 C S2D)。沒(méi)有觀察到紅細(xì)胞或非造血細(xì)胞的 YFP 標(biāo)記(數(shù)據(jù)未顯示)。

     

     

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    2Clec9a +/cre Rosa +/EYFP小鼠表現(xiàn)出 DC 限制性 YFP 表達(dá)

     

    A-C)來(lái)自Clec9a +/+ Rosa +/EYFPClec9a +/cre Rosa +/EYFP小鼠的 BM 流式細(xì)胞術(shù)。顯示了 lin - CD11c - CD115 +細(xì)胞 (A) 和前 DCs (lin - CD11c + CD135 +,平均百分比 ± SDn = 6) (B) 上的 YFP 表達(dá)。YFP +門設(shè)置在來(lái)自Clec9a +/+ Rosa +/EYFP對(duì)照小鼠的細(xì)胞上(未顯示)。(C) MDP YFP +細(xì)胞的百分比 (lin - CD11c - CD115 + CD135 +Clec9a +/cre Rosa +/EYFP小鼠的CD117 hi )、CDPs (lin ? CD11c ? CD115 + CD135 + CD117 low,參見(jiàn)圖 1 A) pre-DCs (lin ? CD11c + CD135 + )

     

    (D-F) Clec9a +/cre Rosa +/EYFPClec9a +/+ Rosa +/EYFP小鼠脾臟的流式細(xì)胞術(shù)分析。(D) 鑒定并分析活 YFP +細(xì)胞是否存在 F4/80 hi自發(fā)熒光(自動(dòng))紅髓 M? CD11c + MHCII + cDC。(E) 進(jìn)一步分析 (D) 中鑒定的 YFP + CD11cMHCII/-細(xì)胞的 Gr-1、SiglecH B220。(F) YFP +細(xì)胞中種群的百分比。(C F)水平條是至少兩次實(shí)驗(yàn)的平均值。

     

    (G H) CD45.1 + B6.SJL CD45.2 + Clec9a +/cre Rosa +/EYFP BM 1:1 混合物靜脈注射致死性輻照小鼠。6-8 周后分析CD11b + CD8α + CD205 + CD11c + MHCII + cDC 的供體 BM 貢獻(xiàn)和 YFP 表達(dá)。(H) Image Stream 中的代表性圖像,顯示 CD11c + CD11b + CD11c + CD11b中的 YFP 信號(hào)-來(lái)自Clec9a +/cre Rosa +/EYFP的脾 DC老鼠。明場(chǎng)圖像顯示樹(shù)突狀細(xì)胞形態(tài)(放大 60 倍)。

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